Distúrbios imunológicos estão associados a doenças inflamatórias e autoimunes, cujos tratamentos atuais apresentam efeitos adversos significativos, evidenciando a necessidade de novas alternativas terapêuticas. Assim, este trabalho avaliou a 7-hidroxiflavona (7HF) como potencial agente imunomodulador em linfócitos murinos e humanos. Por meio de análises in silico, utilizando o ADMETLab e ProTox 3.0, a 7HF não apresentou predição de mutagenicidade, CYP2E1 e CYP2D6. Para as avaliações experimentais, esplenócitos murinos e células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) foram isolados e empregados em ensaios in vitro. A citotoxicidade da 7HF foi avaliada em células não ativadas por ensaio com iodeto de propídio, analisado por citometria de fluxo, não sendo observada citotoxicidade significativa até 40 µM. Para análise da atividade imunomoduladora, esplenócitos e PBMC ativados foram tratados com 7HF (10, 20 e 40 µM). A proliferação linfocitária foi determinada pelo ensaio CellTiter-Glo, observando-se inibição de 10%, 24% e 58% nos esplenócitos e de 16%, 34% e 78% nas PBMC, respectivamente, enquanto a dexametasona promoveu 81% e 59% de inibição. A produção de IL-2 e IFN-γ foi quantificada por ELISA, sendo reduzida pela 7HF em 15–84% e 39–61%, respectivamente, em comparação com a dexametasona (IL-2: 62%; IFN-γ: 37%). A expressão gênica foi avaliada por qRT-PCR, demonstrando supressão de genes próinflamatórios (IL-6, PTGS2/COX-2 e CASP-1) e modulação das vias NFAT, AP-1, JAK/STAT e do receptor de glicocorticoides, com reversão parcial dos efeitos pelo antagonista RU486. Estudos de docking molecular, realizados no software GOLD, indicaram afinidade significativa da 7HF com a calcineurina (ChemPLP = 57,05) e com o receptor glicocorticoide (ChemPLP = 49,54). Em conjunto, os resultados demonstram que a 7HF apresenta atividade imunomoduladora significativa, ausência de citotoxicidade e capacidade de modular alvos moleculares-chave da ativação linfocitária, configurando-se como uma candidata promissora para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas em doenças inflamatórias e autoimunes.