Introdução: A leishmaniose compreende um grupo de enfermidades causada por parasitos pertencentes ao gênero Leishmania. Os medicamentos disponíveis para o tratamento desta doença apresentam diversas limitações, portanto, a identificação de novos fármacos torna-se necessária. Objetivos: Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antileishmania do derivado da classe das N-acilhidrazonas, o (E)– N’– (3,4– dimetoxibenzilideno)– 4– metoxi-N-metilbenzohidrazida (LASSBio-1386), evidenciando o seu mecanismo de ação. Materiais e Métodos: A citotoxicidade foi avaliada frente à macrófagos. A atividade frente as formas promastigotas de L. amazonensis foi avaliada pelo método do AlamarBlue. O CI50 para as formas amastigotas foi calculado a partir da infecção de macrófagos. Os ensaios de ciclo celular, de microscopia eletrônica de transmissão e de potencial de membrana mitocondrial foram realizados a fim de investigar os possíveis mecanismos de ação. A ação do composto em modelo murino de leishmaniose cutânea também foi investigada. Estudos de ancoragem e de dinâmica molecular foram realizados entre a fosfodiesterase B1 de Leishmania (código PDB: 2R8Q) e o LASSBio-1386. Resultados e Discussão: O LASSBio-1386 apresentou baixa citotoxicidade (CC50=55 ± 3,97 µM) e inibiu a proliferação de formas promastigotas de L. amazonensis (CI50=2,4 ± 0,48 µM). O composto reduziu a porcentagem de macrófagos infectados por L. amazonensis e o número de amastigotas/macrófago (CI50= 9,42 ± 0,64 µM). A molécula causou alterações ultraestruturais nas formas amastigotas, causou parada no ciclo celular nas fases G0/G1 e não foi capaz de alterar o potencial de membrana mitocondrial. Em modelo murino de leishmaniose cutânea, o LASSBio-1386 reduziu o tamanho da lesão e a carga parasitária. As análises computacionais sugerem afinidade entre a estrutura química do LASSBio1386 e da fosfodiesterase de Leishmania. Considerações Finais: Os resultados demonstram a atividade antileishmania do LASSBio-1386, in vitro, in vivo e in silico sugerindo uma nova molécula promissora no tratamento da leishmaniose.